BÀI 6: THỰC HÀNH: TÁCH
CHIẾT DNA
I. YÊU CẦU CẦN ĐẠT
- Mục tiêu thực hành: Thực hành và thực hiện thành công quy trình tách
chiết DNA từ các mẫu vật sống (mô gan động vật hoặc mô thực vật).
II. CHUẨN BỊ
1. Dụng cụ, thiết bị
- Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm:
+ Chày, cối sứ hoặc máy xay thịt, máy nghiền mẫu vật sống.
+ Ống nghiệm thuỷ tinh, giá đỡ ống nghiệm, giấy lọc và phễu
lọc.
+ Tăm tre dài hoặc que
tre tròn, que thuỷ tinh.
2. Nguyên liệu, hoá
chất, mẫu vật
- Nguyên liệu và hoá
chất:
+ Mẫu vật: Gan gà hoặc
gan lợn tươi sống (khoảng 5 g), hoặc mô thực vật (khoảng 50 g).
+ Dứa tươi: 1/4 quả.
+ Nước rửa chén bát (dung
dịch tẩy rửa): 500 mL.
+ Cồn ethanol lạnh (70 –
95%): 500 mL.
- Lưu ý khi lựa chọn mẫu
vật:
+ Mô thực vật thường chứa
nhiều nước, ít DNA hơn mô động vật và có sắc tố (diệp lục) cần loại bỏ.
+ Nên ưu tiên sử dụng gan
gà hoặc gan lợn vì tế bào mềm dễ nghiền, hàm lượng DNA cao.
III. NGUYÊN LÍ
VÀ CÁCH TIẾN HÀNH
1. Nguyên lí
- Cơ sở khoa học của quy
trình tách chiết DNA:
+ Phá vỡ mô và màng tế
bào: Nghiền cơ học để tách rời tế bào; dùng chất tẩy rửa (nước rửa chén) hòa
tan lớp lipid kép của màng sinh chất và màng nhân nhằm giải phóng dịch nhân
chứa DNA.
+ Loại bỏ protein: Sử
dụng enzyme protease có trong dịch ép quả dứa tươi để thủy phân protein liên
kết với DNA (histone, enzyme phiên mã, protein điều hòa) thành các peptide nhỏ
và amino acid tự do.
+ Kết tủa và thu nhận
DNA: Cồn ethanol lạnh có ái lực với nước mạnh hơn DNA, làm mất lớp vỏ hydrate
khiến các phân tử DNA kết tụ lại thành sợi màu trắng đục; cồn nhẹ hơn nước nên
lớp kết tủa nổi lên phía trên ống nghiệm.
❖ Bảng tổng hợp vai trò của các tác nhân trong quy trình tách chiết DNA
|
Hóa
chất / Tác nhân |
Cơ
chế tác động |
Vai
trò trong quy trình |
|
Nghiền cơ học (cối sứ/máy xay) |
Tác động lực vật lí làm vỡ cấu trúc mô và thành tế bào (ở
thực vật) |
Giải phóng các tế bào riêng rẽ |
|
Nước rửa chén (chất tẩy rửa) |
Hòa tan lớp kép phospholipid của màng sinh chất và màng
nhân |
Phá hủy màng tế bào, giải phóng DNA và protein vào dung
dịch |
|
Nước dứa tươi (chứa Protease) |
Thủy phân liên kết peptide trong chuỗi polypeptide của
protein histone |
Giải phóng DNA dạng trần, tách rời khỏi các protein liên
kết |
|
Cồn ethanol lạnh (70 - 95%) |
Giảm độ tan của DNA do ái lực cao với nước; nhiệt độ lạnh
bảo vệ DNA không bị biến tính hoàn toàn |
Làm DNA kết tủa thành các sợi trắng đục nổi lên trên bề mặt |
❖ Cơ chế / Diễn biến / Sơ đồ: Mẫu vật gan (nghiền cơ học) → Bổ sung nước rửa chén
(phá vỡ màng lipid) → Bổ sung enzyme protease từ nước dứa (phân giải protein
histone) → Bổ sung cồn ethanol lạnh (DNA kết tủa trắng nổi lên trên)
2. Cách tiến hành
- Các bước thực nghiệm tách chiết DNA từ gan gà:
+ Bước 1 (Nghiền mẫu): Nghiền kĩ 5 g gan gà trong cối sứ
(hoặc máy xay 30 - 60 giây). Bổ sung 150 mL nước lạnh, khuấy đều. Nghiền 1/4
quả dứa đã gọt vỏ, lọc lấy nước dứa cho vào ống nghiệm.
+ Bước 2 (Lọc dịch tế bào): Lọc hỗn dịch gan qua phễu có giấy
lọc để loại bỏ bã và cặn, thu lấy phần dịch trong.
+ Bước 3 (Phá vỡ màng tế bào): Cho dịch lọc vào ống nghiệm
cùng 30 mL dung dịch nước rửa chén pha loãng, khuấy đều, để yên trên giá 5 - 10
phút.
+ Bước 4 (Phân giải protein): Rót dịch từ bước 3 sang ống
nghiệm mới (chiếm 1/3 - 1/2 thể tích ống); cho thêm 5 mL nước dứa tươi, khuấy
nhẹ và để yên 10 phút.
+ Bước 5 (Kết tủa DNA): Rót nhẹ cồn ethanol lạnh theo thành
ống nghiệm đến khi gần đầy; để yên vài phút, các sợi kết tủa DNA màu trắng đục
sẽ nổi lên lớp cồn phía trên; dùng tăm tre hoặc que thủy tinh xoay nhẹ để cuộn
lấy sợi DNA ra ngoài.
- Lưu ý thao tác kĩ thuật:
+ Khi rót cồn cần rót từ từ nghiêng theo thành ống nghiệm để
tạo thành 2 lớp phân tách rõ rệt, không khuấy mạnh làm tan lớp cồn.
+ Thao tác cuộn tăm tre lấy sợi DNA phải thật nhẹ tay để
tránh làm đứt gãy sợi DNA.
❖ Cơ chế / Diễn biến / Sơ đồ: Sơ đồ 5 bước: Bước 1 (Nghiền gan + ép nước dứa) → Bước
2 (Lọc qua phễu lấy dịch trong) → Bước 3 (Bổ sung nước rửa chén, chờ 5-10 phút)
→ Bước 4 (Bổ sung 5 mL nước dứa, chờ 10 phút) → Bước 5 (Rót cồn lạnh theo thành
ống, cuộn lấy DNA kết tủa)
IV. THU HOẠCH
- Cấu trúc báo cáo thực hành của học sinh:
1. Mục đích thí nghiệm.
2. Kết quả thu được và giải thích hiện tượng quan sát được.
3. Trả lời các câu hỏi thu hoạch sau bài thực hành.