BÀI 6: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME
I. QUY TRÌNH TỔNG QUÁT
- Enzyme là các chất xúc
tác sinh học có bản chất là protein, rất dễ bị mất hoạt tính khi bị tách khỏi tế
bào hoặc cơ thể.
- Quy trình sản xuất enzyme
tổng quát gồm 3 giai đoạn chính nối tiếp nhau:
+ Giai đoạn 1: Tạo nguồn
thu enzyme.
+ Giai đoạn 2: Tách chiết
enzyme.
+ Giai đoạn 3: Tạo chế phẩm
enzyme.
1. Giai đoạn 1: Tạo nguồn thu enzyme
a. Bước 1. Chọn nguồn nguyên liệu cung cấp
enzyme
- Enzyme có trong tế bào của
mọi cơ thể sinh vật (động vật, thực vật, vi sinh vật).
- Hiện nay, vi sinh vật
là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu nhất trên thế giới và nước ta nhờ các ưu điểm
vượt trội:
+ Có chu kỳ sinh trưởng ngắn,
tốc độ sinh sản cực nhanh.
+ Dễ dàng nuôi cấy nhân tạo
với quy mô lớn, chi phí thấp.
+ Con người có thể chủ động
điều khiển quá trình tổng hợp enzyme bằng công nghệ di truyền.
Bảng một số enzyme có nguồn gốc từ các
nhóm sinh vật:
|
Nguồn
enzyme |
Tên
enzyme tiêu biểu |
|
Động vật |
Catalase (gan); rennin (dạ dày bê); chymotrypsin,
lipase, trypsin (tụy) |
|
Thực vật |
Actinidin (quả kiwi); bromelain (quả dứa); papain
(quả đu đủ); amylase, glucanase (mầm đại mạch) |
|
Vi khuẩn |
Asparaginase (E. coli); amylase, glucose
isomerase, penicillin amidase, protease (Bacillus) |
|
Nấm |
- Cellulase (Trichoderma); lipase (Rhizopus);
rennin (Mucor miehei); dextranase (Penicillium); amylase,
aminoacylase, catalase, glucoamylase, glucosidase, lactase, pectinase,
protease (Aspergillus) |
b. Bước 2. Nuôi cấy vi sinh vật được lựa
chọn
- Để tăng hàm lượng enzyme,
vi sinh vật cần được nuôi cấy trong điều kiện môi trường đặc biệt, giàu dinh dưỡng.
- Có hai phương pháp nuôi cấy
vi sinh vật chính:
+ Phương pháp nổi (nuôi cấy bề mặt):
Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn (cám mì, cám gạo...) được làm
ẩm và vô trùng. Chế phẩm thu được thường ở dạng thô. Phương pháp này cho hàm lượng
enzyme cao nhưng khó tự động hóa.
+ Phương pháp chìm (nuôi cấy bề sâu): Vi
sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, có sục khí và khuấy đảo liên tục.
Phương pháp này có ưu điểm dễ tự động hóa nhưng hàm lượng enzyme thường thấp
hơn và chi phí thiết bị cao hơn.
2. Giai đoạn 2: Tách chiết enzyme
a. Bước 1. Phá vỡ cấu trúc tế bào
- Đối với enzyme nội bào
(nằm bên trong tế bào): Bắt buộc phải phá vỡ màng và thành tế bào để giải phóng
enzyme bằng các biện pháp cơ học, vật lý hoặc hóa học.
+ Biện pháp cơ học: Nghiền
thô với bột thủy tinh, cát thạch anh, hoặc đồng hóa áp lực cao.
+ Biện pháp vật lý: Sử dụng
sóng siêu âm, hoặc làm đông lạnh - rã đông đột ngột để làm vỡ tế bào.
+ Biện pháp hóa học/sinh học:
Dùng dung môi hữu cơ (butanol, acetone...), chất tẩy rửa, hoặc dùng dung dịch
nhược trương để tế bào tự trương vỡ.
- Đối với enzyme ngoại
bào (được tế bào tiết ra môi trường): Không cần thực hiện bước phá vỡ tế
bào, chỉ cần lọc bỏ sinh khối vi sinh vật để thu dịch chứa enzyme.
b. Bước 2. Tách chiết enzyme
- Enzyme được hòa tan vào
nước cất, dung dịch đệm hoặc muối trung tính.
- Để thu nhận enzyme thô,
người ta tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ lạnh (như ethanol,
acetone) hoặc muối trung tính (như ammonium sulfate (NH₄)₂SO₄) ở nhiệt độ thấp
(từ 3 °C đến 5 °C) để tránh enzyme bị biến tính.
- Để thu nhận enzyme tinh
khiết (dùng trong y học và nghiên cứu): Dịch chiết thô phải trải qua quá trình
lọc thẩm tích, phối hợp các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp
phụ...).
3. Giai đoạn 3: Tạo chế phẩm enzyme
- Chế phẩm enzyme sau khi
tinh sạch và cô đặc cần được phối trộn với các chất bảo vệ để duy trì hoạt tính
xúc tác (giữ nguyên cấu hình không gian 3 chiều).
- Tá dược thường dùng: Tinh
bột, lactose, carboxymethyl cellulose, glycerin...
- Dạng chế phẩm:
+ Dạng lỏng/dung dịch/huyền
phù: Khó bảo quản lâu, dễ bị phân hủy.
+ Dạng bột khô/viên nhỏ (tạo
ra bằng phương pháp đông khô): Có ưu điểm vượt trội về độ bền hoạt tính, dễ vận
chuyển và bảo quản được rất lâu.
II. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ THU NHẬN MỘT SỐ
ENZYME
1. Quy trình sản xuất amylase theo phương
pháp nuôi cấy nổi
- Đối tượng sử dụng: Chủng
nấm mốc Aspergillus oryzae.
- Sơ đồ quy trình:
Chọn
và nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae trên môi trường cám mì
↓
Tách
chiết bằng nước
↓
Thẩm
tích dịch chiết
↓
Kết
tủa amylase (bằng cồn hoặc acetone)
↓
Sấy
kết tủa amylase
↓
Chế
phẩm amylase
2. Quy trình sản xuất enzyme protease theo
phương pháp nuôi cấy chìm
- Đối tượng sử dụng: Nấm mốc
Aspergillus niger hoặc vi khuẩn thích hợp nuôi cấy trong môi trường lỏng
rỉ đường.
- Sơ đồ quy trình:
Rỉ đường → Hấp thanh trùng → Trộn vi sinh vật
(Aspergillus niger) → Nuôi cấy
↓
Chế phẩm thô → Đem sử dụng trong chăn nuôi
↓ (Nghiền, lọc)
Bã
↓
Kết tủa protease bằng cồn
↓
Sấy kết tủa
↓
Thu nhận chế phẩm protease
3. Quy trình sản xuất enzyme protease tái
tổ hợp
- Khắc phục hạn chế của
phương pháp truyền thống (hiệu suất thấp, tạp chất nhiều) bằng việc áp dụng
công nghệ DNA tái tổ hợp.
- Quy trình gồm 7 bước tối
ưu:
+ Bước 1: Lựa chọn, phân lập
chủng vi sinh vật cho enzyme protease có hoạt tính tốt nhất.
+ Bước 2: Xác định gene mã
hóa tổng hợp enzyme protease.
+ Bước 3: Tạo vector tái tổ
hợp.
+ Bước 4: Biến nạp vector
tái tổ hợp vào tế bào chủ (ví dụ vi khuẩn E. coli hoặc nấm men).
+ Bước 5: Sàng lọc dòng tế
bào mang vector tái tổ hợp.
+ Bước 6: Lên men tế bào chủ
để thu nhận sản phẩm protease lượng lớn.
+ Bước 7: Tách chiết, tinh
sạch thu chế phẩm protease tái tổ hợp có độ tinh sạch cực cao.
4. Quy trình thu nhận enzyme urease
- Nguồn nguyên liệu chính:
Hạt đậu rựa (Canavalia gladiata), chứa tới 20% chất khô là enzyme
urease.
- Sơ đồ quy trình:
Nghiền
hạt đậu rựa trong dung dịch HCl 0,4%
↓
Li
tâm loại bỏ bã
↓
Dịch
chiết thô
↓
Xử
lý nhiệt (60 °C, 30 phút) và li tâm
↓
Lọc
qua màng siêu lọc để thu siêu dịch lọc
↓
Kết
tủa bằng acetone lạnh (tỉ lệ 1:1)
↓
Kết
tủa urease
↓
Hòa
tan kết tủa, chạy sắc ký trao đổi ion
↓
Sấy
thăng hoa
↓
Chế
phẩm urease tinh sạch (hoạt tính gấp 25 lần dịch thô)